化学修饰热启动Taq PCR预混液(染料法)

产品货号：

BM0350

中文名称：

化学修饰热启动Taq PCR预混液(染料法)

英文名称：

2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix

产品规格：

5mL

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是SYBR Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经化学法修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。

组分	规格
2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix	5×1mL
Low ROX Dye (100×)	100μL
High ROX Dye (100×)	100μL

保存：-20℃，避免反复冻融

适配机型

None ROX：Bio-Rad CFX全系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Mastercycler ep realplex系列；Qiagen/Corbett Rotor-Gene系列；Takara Thermal Cycler Dice；analytikjena qTOWER系列等。
Low ROX：ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7；ABI QuantStudio系列；Stratagene Mx3000P/3005P/4000。
High ROX：ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast，StepOne，StepOne Plus等。

因Mix中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡；
可在首次试验前根据“适配机型”表格内容选择合适的ROX Dye一次性加入Mix管内。加入终浓度为2×（1mL mix加入20μL ROX Dye）。

扩增产物长度建议控制在80～200bp；
引物长度为18～25bp；
正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值控制在58～62℃为佳；
引物的GC含量控制在40%～60%之间；
引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避开T/C或者A/G的连续结构（特别是3'端）；
引物3'端最后一个碱基最好为G或者C；
避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；
使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。

若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：

引物浓度调整：当引物终浓度在0.1～1.0μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。
扩增程序优化：需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

建议的qPCR反应体系

成分	用量	终浓度
2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix	10μL	1×
正向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
反向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
ROX（依据机型选择）	0.2μL	1×
DNA模板	X μL	10～200ng/20μL
Nuclease-Free Water	至20μL	-

通常推荐的引物终浓度为0.2μM，反应效果不佳时可在0.1～1μM范围内进行调整；
推荐模板加样量为1～2μL，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。

qPCR反应程序（可根据机型适当调整）
- 两步法（推荐）
  步骤温度时间循环数
  预变性 95℃ 10min 1
  变性 95℃ 15sec 40
  退火&延伸 60℃ 30sec
  熔解曲线使用仪器默认采集程序
- 三步法
  步骤温度时间循环数
  预变性 95℃ 10min 1
  变性 95℃ 15sec 40
  退火 55～65℃ 15sec
  延伸 72℃ 30sec
  熔解曲线使用仪器默认采集程序
- 根据引物的Tm值进行退火（退火&延伸）温度的设定；若扩增片段在200bp以内，延伸(退火&延伸)时间可以设置为15sec；此外，延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整；
- 不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。

问题描述	可能原因	解决办法
扩增曲线不光滑	荧光信号太弱，经系统校正后产生	确保Mix中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。
扩增曲线断裂或下滑	模板浓度较高，基线的终点值大于Cq值	减小基线终点(Cq值-4)，重新分析数据。
个别孔扩增曲线突然骤降	反应管内留有气泡	确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡；延长预变性时间至10min，以去除气泡。
反应结束无扩增曲线出现	反应循环数偏少	设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号。
	荧光信号采集步骤未设置或者设置错误	两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
	引物可能降解	长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。
	模板降解	重新制备模板，重复实验。
Cq值出现过晚	扩增效率低	提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。
	模板降解	重新制备模板，重复实验。
	扩增产物过长	扩增产物长度控制在80～200bp。
	体系中存在PCR抑制剂	一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。
空白对照出现信号	反应体系污染	首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Mix；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
空白对照出现信号	出现引物二聚体等非特异性扩增	一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序。
熔解曲线出现多峰	引物设计不佳	根据引物设计原则重新设计新引物。
	引物浓度过高	适当降低引物浓度。
	cDNA模板存在基因组污染	提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物。
实验重复性差	加样误差大	使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液；高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差；放大qPCR反应体积。
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验
	qPCR仪不同位置的温度偏差	定期校准qPCR仪

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10min	1
变性	95℃	15sec	40
退火&延伸	60℃	30sec	40
熔解曲线	使用仪器默认采集程序

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